     北京中医药大学基础医学院    陈明  (北京 100029)

    摘要:目的探讨百福生胶囊对人肝癌细胞有丝分裂和细胞周期的影响；方法  将百福生提取液注入经细胞培养的人肝癌细胞，并设血清对照组和无血清对照组；结果  人肝癌SMMC-7721细胞经百福生提取液处理后，细胞分裂指数减少，于细胞增殖期24h、48h的细胞分裂指数分别为：0.51%、0.27%，同时可人肝癌细胞DNA复制及蛋白质的合成，阻滞肿瘤细胞从S期进入G2/M期；结论  百福生提取液可使细胞有丝分裂中止、阻滞其恶性分裂、增殖、杀伤癌细胞，从而防止肿瘤复发、转移。

    近年来研究表明：百福生胶囊作为生物反应调节剂用于肿瘤的临床治疗，可直接杀灭肿瘤细胞、诱导肿瘤细胞分化、抑制血管形成，从而抑制肿瘤生长和转移[1]。本实验旨在从细胞有丝分裂和细胞周期角度进一步探讨百福生胶囊抗肿瘤作用的机理，我们应用百福生胶囊对人肝癌SMMC-7721细胞有丝分裂和细胞周期的影响进行实验研究，现报告如下：
    1、材料与方法
    1.1 实验材料
    1.1.1 实验细胞株：人肝癌SMMC-7721细胞株来源于中国科学院上海细胞库。
    1.1.2 百福生提取液的制备：百福生胶囊由郑州博生医药技术发展有限公司提供，称取百福生提取物10g，按一定的比例加入适量蒸馏水，将百福生提取液稀释制备，使其终浓度稀释成5×10—4 mol/L，备用。
    1.2 实验方法
    1.2.1 细胞培养  用含RPMI1640、10%小牛血清、100U/mL青霉素、100mg/ml链霉素的培养液，置37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温箱中悬浮培养人肝癌SMMC-7721细胞，每2-3天传代一次。
    1.2.2 有丝分裂指数  将对数期生长的人肝癌SMMC-7721细胞调浓度1×10^5/mL，接种于24孔培养板(Corning公司)，内置盖片，每孔2ml，10%FCS的1640培养液中培养24h，弃上清，RPMI1640漂洗后，实验组换入含终浓度5×10—4 mol/L的百福生提取液，对照组换入RPMI1640，血清对照组换入含10%FCS的1640，每组设三个重复孔，继续培养24h后，取出盖片，Carnoy固定液固定［2］。分别于加药后6h、12h、24h、48h内收集细胞，以观察细胞有丝分裂情况。HE染色法染色，用高倍(10×40)观察人肝癌细胞的有丝分裂图像，记数5个以上的高倍视野中的癌细胞有丝分裂数目，取其平均值，即每个高倍视野中的有丝分裂细胞数为有丝分裂指数(mitotic index)，以MI表示［3］。
    2 结果
    2.1 百福生提取液对细胞有丝分裂的影响   从表1可见，无血清对照组在细胞增殖期内24h和48h，其细胞有丝分裂指数分别为：5.92%、6.22%，血清对照组在细胞增殖期内24h和48h，其细胞有丝分裂指数分别为：5.832%、6.31%，而实验组的人肝癌SMMC-7721细胞经百福生提取液处理后，细胞分裂指数减少，于细胞增殖期6h、12h、24h、48h的细胞分裂指数分别为：1.33%、0.77%、0.51%、0.27%，分裂相多停留在分裂中期，阻断癌细胞的有丝分裂，使癌细胞的形态和功能发生变化，从而杀伤癌细胞、阻滞癌细胞的恶性分裂，实验中还观察发现，经百福生提取液处理的人肝癌细胞增殖率明显下降，存活率下降，肿瘤细胞增殖缓慢。实验组有丝分裂指数(MI)明显低于无血清对照组和血清对照组，组间比较，差异有显著意义(P<0.05、0.01)。
    表1  百福生提取液对人肝癌细胞有丝分裂指数的影响
分  组
分裂指数(MI)(%)  (x±s)
    6h        12h         24h           48h

无血清对照组
5.07±0.14   5.31±0.32     5.92±0.28     6.22±0.16
血清对照组 5.10±0.22   5.28±0.65    5.83±0.31     6.31±0.28
实  验  组 1.33±0.13*# 0.77±0.10**## 0.51±0.06**## 0.27±0.03**##
注：实验组与血清对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；
实验组与无血清对照组比较，#P<0.05，##P<0.01。
    2.3  百福生提取液对细胞周期的影响   通过对百福生提取液(实验组)与空白对照组胞周期时相的观察，结果发现，百福生提取液组在S期和G2/M期细胞增多明显，表明百福生提取液可通过干扰肿瘤细胞生长，抑制人肝癌细胞的DNA复制及蛋白质的合成，阻滞肿瘤细胞从S期进入G2/M期（见表2），阻止癌细胞增殖，从而防止肿瘤复发、转移。
    表2  百福生提取液对人肝癌细胞周期时相的作用
分  组 G0/C1       S            G2/M

空白对照组 72.0487     11.2546         12.0845
实  验组 41.3308*    81.4913**       83.3047**
注：实验组与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；
    3  讨论
    恶性肿瘤的有丝分裂象对于判断肿瘤病人的疗效及预后有一定的参考价值［4］，阻滞肿瘤细胞有丝分裂，改变细胞周期已成为当今肿瘤治疗的一个新热点，尤其是在抗肿瘤药物的筛选及作用机制的研究方面为人们提供了新的思路。百福生胶囊作为一种纯天然生物反应调节剂，其主要提取物有效成分为葡聚糖及皂甙等。实验研究证明百福生胶囊对多种瘤株都具有明显的抑制作用，同时能延长荷瘤小鼠的生存期［5］。本实验选用百福生提取液，观察其对人肝癌SMMC-7721细胞有丝分裂和细胞周期的影响，实验结果表明：百福生提取液可调控细胞的有丝分裂，使细胞分裂停止在有丝分裂中期，促使癌细胞的形态和功能发生变化，从而使细胞有丝分裂中止、阻滞其恶性分裂、增殖、杀伤癌细胞。
    细胞周期的研究对探索肿瘤的发生、发展和治疗极其重要。大量研究表明：肿瘤的恶性程度与细胞周期密切相关，处于细胞周期不同时相的肿瘤细胞对药物的敏感程度不同，一般情况下处于增殖期的细胞较为敏感。百福生提取液可通过干扰肿瘤细胞生长，抑制肝癌细胞的DNA复制及蛋白质的合成，阻滞肿瘤细胞从S期进入G2/M期，阻止癌细胞增殖，从而防止肿瘤复发、转移，这一研究为百福生胶囊的临床应用提供了一定的科学依据。

参考文献：
［1］倪进军,朱霞，百福生胶囊治疗恶性肿瘤放化疗后外周血细胞减少症的临床研究，深圳中西医结合杂志，2002,12(4):287
［2］宋景贵,肖正明，李师鹏等，柴胡提取物对人肝癌细胞和小鼠S－180肉瘤的抑制作用，山东中医药大学学报，2001,25(4):300-301
［3］钟碧玲,宗永生，癌细胞有丝分裂和凋亡对鼻咽癌生长的影响，肿瘤，2001,21(4):257)
［4］Christei B,Janos V,Differential staining of mitoses in tissue sections and cultured  cells by a modified methenamine-silver method.Laboratory Lnvestigation,1988,59(6):878
［5］邵素霞,邓木秀，百福生胶囊对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用研究，陕西肿瘤医学，2002,10(4):288